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2019年1月CRISPR/Cas最新研究进展时间:2019-02-28



谷 君 说

Cas是CRISPR相关蛋白的简称,最初是在细菌体内发现的,是细菌用来识别和摧毁抗噬菌体和其他病原体入侵的防御系统。 


2019年1月CRISPR/Cas最新研究进展


基因组编辑技术CRISPR/Cas9被《科学》杂志列为2013年年度十大科技进展之一,受到人们的高度重视。CRISPR是规律间隔性成簇短回文重复序列的简称,Cas是CRISPR相关蛋白的简称。CRISPR/Cas最初是在细菌体内发现的,是细菌用来识别和摧毁抗噬菌体和其他病原体入侵的防御系统。 

图片来自Thomas Splettstoesser (Wikipedia, CC BY-SA 4.0)。 


2018年11月26日,中国科学家贺建奎声称世界上首批经过基因编辑的婴儿---一对双胞胎女性婴儿---在11月出生。他利用一种强大的基因编辑工具CRISPR-Cas9对这对双胞胎的一个基因进行修改,使得她们出生后就能够天然地抵抗HIV感染。这也是世界首例免疫艾滋病基因编辑婴儿。这条消息瞬间在国内外网站上迅速发酵,引发千层浪。有部分科学家支持贺建奎的研究,但是更多的是质疑,甚至是谴责。


过去的1月份,有哪些重大的CRISPR/Cas研究或发现呢?小编梳理了一下生物谷报道的CRISPR/Cas研究方面的新闻,供大家阅读。



1.我国科学家成功克隆出5只基因编辑猴子作为生物节律紊乱动物模型

doi:10.1093/nsr/nwz002; doi:10.1093/nsr/nwz003

2019年1月24日,在两篇发表在
National Science Review期刊上的论文中,中国研究人员克隆出5只基因编辑猕猴。这两篇论文的标题分别为“BMAL1 knockout macaque monkeys display reduced sleep and psychiatric disorders”和“Cloning of a Gene-edited macaque monkey by somatic cell nuclear transfer”。

这些基因编辑猕猴通过体细胞核移植方法克隆出来。在大约一年前,这种方法被用来克隆出世界上第一只灵长类动物(也是猕猴)。但是,在这两篇新的论文中,这些研究人员首先利用CRISPR-Cas9对这些猴子的基因组进行编辑,具体而言就是敲除在昼夜节律调节中起着重要作用的基因BMAL1,让它们出现睡眠障碍的症状。

根据中国科学院神经科学研究所非人灵长类动物研究平台主任孙强(Sun Qiang)在一份新闻稿中的说法,这些研究人员随后挑选出发生“正确的基因编辑和具有最严重的疾病表型”的猴子进行克隆。

这些研究人员在这些克隆猕猴中观察到的疾病迹象包括失眠和血液激素的变化,以及焦虑、抑郁和“
精神分裂症样(schizophrenia-like)”行为的增加。


2.Nature:重磅!首次成功地在哺乳动物中进行基因驱动
doi:10.1038/s41586-019-0875-2

基因驱动(gene drive)是一种基因工程技术,它促进后代要比正常情形时更频繁地遗传来自一个亲本的特定等位基因。它已在昆虫中发挥作用。如今,在一项新的研究中,来自美国加州大学圣地亚哥分校的研究人员发现它也能够成功地在脊椎动物中发挥作用。在这项研究中,他们描述了一种方法,它利用CRISPR-Cas9改变雌性小鼠生殖系细胞,从而促进小鼠后代出现白色毛发和表达一种红色荧光蛋白。


相关研究结果于2019年1月23日在线发表在Nature期刊上,论文标题为“Super-Mendelian inheritance mediated by CRISPR–Cas9 in the female mouse germline”。

根据论文通讯作者、加州大学圣地亚哥分校进化发育生物学家Kimberly Cooper的说法,启动这个研究项目的原因在于她和她的团队想要能够复制其他物种的遗传变化,这样他们就能够理解这些变化如何导致特定性状。


但是,利用传统的小鼠遗传学,将多个转基因组合在一起并且让小鼠中每个转基因的两个等位基因保持纯合是很棘手的。比如,在两只小鼠中,让每只小鼠携带相同的三个基因的突变拷贝需要将近150个后代才有90%的机会让它们中的一个后代是纯合的三重突变体。


3.基因编辑大牛张锋新力作!发现第三种CRISPR-Cas系统,显著降低脱靶效应

doi:10.1038/s41467-018-08224-4

来自原核生物CRISPR/Cas系统的酶已被用作可编程的和高度特异性的基因组编辑工具。目前的基因组编辑技术集中在II型CRISPR-Cas系统上,该系统含有单个用于DNA切割的蛋白效应核酸酶。


然而,到目前为止,仅有两个II型核酸酶家族用于人细胞中的基因组编辑:Cas9,即一种由两个向导RNA(gRNA)引导的核酸酶,含有两个核酸酶结构域:HNH和RuvC,其中这两个gRNA为CRISPR RNA(crRNA)和tracrRNA;Cas12a,即一种由单个gRNA引导的核酸酶,含有单个结构域:RuvC,其中这单个gRNA为crRNA。 

在一项新的研究中,来自美国布罗德研究所的张锋(Feng Zhang)及其团队着重关注第三种II型蛋白效应核酸酶:Cas12b,即一种由两个gRNA引导的核酸酶,含有单个结构域:RuvC,其中这两个gRNA为crRNA和tracrRNA。


尽管Cas12b蛋白通常比Cas9和Cas12a小,因而从通过病毒载体进行细胞内递送的观点来看具有吸引力,但是得到最好描述的来自嗜酸耐热菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)的Cas12b核酸酶(AacCas12b)在48°C时表现出最佳的DNA切割活性,这阻止它在哺乳动物细胞中的应用。


张锋团队试图鉴定出在较低温度下有活性的Cas12b家族成员,这样就可用于人类基因组编辑。相关研究结果于2019年1月22日发表在Nature Communications期刊上,论文标题为“Engineering of CRISPR-Cas12b for human genome editing”。

鉴于强效的基因组编辑工具应当在一系列靶标上是高效的和特异性的,张锋团队在针对293T细胞中的5个基因的56个靶位点上测试了BhCas12b v4突变体,结果观察到强效的DNA切割。接着,他们通过电穿孔技术将BhCas12b v4-sgRNA复合物递送到人CD4+ T细胞中。在3个测试的靶位点上,这些复合物表现出的indel发生率为32%~49%。这些数据表明BhCas12b v4突变体在多种基因组编辑环境下(包括一种在治疗上有重大意义的人细胞类型)可作为一种有效的可编程的核酸酶。 

最终,张锋团队试图确定BhCas12b在人细胞中的全基因组靶向特异性。他们选择了9个在不同Cas核酸酶之间表现出相当的indel活性的靶位点,并进行了Guide-Seq分析。针对BhCas12b v4突变体或AsCas12a,他们并没有检测到任何脱靶位点的存在,然而来自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的Cas9(SpCas9)在其中的6个靶位点上表现出显著的脱靶切割。


在14个非匹配性的位点上开展的进一步Guide-Seq实验表明BhCas12b v4突变体仅在2个位点上检测到脱靶切割。与这些发现相一致的是,当gRNA和靶DNA之间的位点1~20上发生双位点错配时,他们观察到有限的indel活性,而且对单个位点错配表现出较低的耐受性。这些结果对在人细胞中观察到的较低的脱靶活性提供了一种分子水平上的解释。

4.eLife:Crispr基因编辑技术有助于治疗寄生虫感染
doi:10.7554/eLife.41337; doi:10.7554/eLife.41463

乔治华盛顿大学(GW)的研究人员以及泰国,澳大利亚,英国和荷兰等研究所的同事们首次成功地使用基因编辑工具CRISPR / Cas9来限制血吸虫病和肝吸虫感染的影响。他们的研究结果发表在今天发表在
eLife期刊上的两篇论文中。

“在我们的动物模型中,使用CRISPR / Cas9'敲除'的基因导致感染症状显着减少,”作者说道 “我们的研究还表明,这种革命性的新生物医学程序-CRISPR / Cas9-可用于研究蠕虫寄生虫,这是热带气候中的主要公共卫生问题。”

血吸虫病可引起严重的健康问题,包括肝脏和肾脏受损,不育和膀胱癌。淡水蠕虫曼氏血吸虫通过钻入皮肤进入人体;一旦进入血液,它们会移动到各种器官,在那里它们迅速开始繁殖。他们的卵释放出几种分子,包括一种叫做omega-1核糖核酸酶的蛋白质,可以破坏周围的组织。 Brindley和他的研究团队使用CRISPR / Cas9“敲除”了这种蛋白质,并发现它大大降低了这种疾病的影响。

肝吸虫O. viverrini感染可引起一种称为胆管癌的肝癌。这种寄生虫通过摄入未经烹煮或未煮熟的鱼传播。一旦进入体内,寄生虫就会沉淀在人体肝脏中并分泌一种叫做颗粒蛋白的蛋白质,这种蛋白质可能会促使肝细胞繁殖,从而增加患癌症的风险。 Brindley和他的研究团队使用CRISPR / Cas9去除编码颗粒体的基因,并产生只能产生极少量蛋白质的寄生虫,导致肝吸虫感染的症状明显减轻。


5.Cell:利用CRISPR-Cas9鉴定出新的辅助性T细胞调节基因

doi:10.1016/j.cell.2018.11.044

T细胞是免疫系统中的关键细胞。在一项新的研究中,来自英国威康基金会桑格研究所和芬兰图尔库大学的研究人员构建出首个逆转录病毒CRISPR-Cas9基因编辑文库来探究对小鼠T细胞的调节。他们绘制出控制辅助性T细胞(T helper cell, Th)的最为重要的基因的图谱,并鉴定出几个新的调节基因。基于此,他们揭示了很多不同的基因参与Th细胞激活和发育的复杂控制机制。理解是什么调节T细胞发育可能有助于发现新的药物来抵抗免疫系统过度活跃导致的过敏和类风湿性关节炎等自身免疫疾病。


此外,这些发现也可能有助于科学家们开发新的疗法来激活免疫系统,从而抵抗感染或攻击肿瘤细胞。相关研究结果于2019年1月10日在线发表在Cell期刊上,论文标题为“Genome-wide CRISPR Screens in T Helper Cells Reveal Pervasive Crosstalk between Activation and Differentiation”。 

免疫系统保护身体免受感染和肿瘤的侵害。2型辅助性T细胞(T helper type 2, Th2)是免疫系统中的关键组成部分,它们释放特定的化学物质来告诉身体杀死入侵者。当检测到入侵者时,Th2细胞被激活。它们随后需要沿着正确的途径进行发育以便最好地协助清除特定的感染,这一过程称为分化。然而,仍然不清楚的是究竟是什么信号激活这些细胞或告诉它们如何发育以及释放哪些化学信号。

为了研究这一点,这些研究人员构建出一个新的由8.8万个向导RNA(gRNA)组成的全基因组CRISPR文库。这些gRNA让他们能够关闭来自小鼠Th2细胞的2万个基因中的每一个。在模拟体外培养的Th2细胞受到感染后,他们研究了关闭基因组中的每个基因如何影响它们的激活或分化。他们发现了许多参与调节Th2细胞发育的不同基因,并确定了一个基因调控网络。

 

6.Cell:给Cas9一个开启开关,从而更好地控制CRISPR基因编辑
doi:10.1016/j.cell.2018.11.052

在一项新的研究中,来自美国加州大学伯克利分校的研究人员利用一种称为循环排列(circular permutation)的技术,构建出一套称为Cas9-CP的新型Cas9变体,这将简化Cas9融合蛋白的设计,使得它们能够用于除了简单的DNA切割之外的多种应用,比如碱基编辑和表观遗传修饰。相关研究结果发表在2019年1月10日的Cell期刊上,论文标题为“CRISPR-Cas9 Circular Permutants as Programmable Scaffolds for Genome Modification”。

通过这个相同的过程,这些研究人员将“永远开启(always-on)”的Cas9分子转变为可激活的开关。这些开关保持在“关闭”位置,直到它们被蛋白酶激活。由此产生的蛋白酶感应的Cas9(protease-sensing Cas9, ProCas9)能够减少脱靶效应并实现分子感应,以及组织或器官特异性的基因组编辑。他们证实ProCas9可用于检测病毒蛋白酶,从而潜在地用作一种能够引发免疫反应的病原体感应系统。

Savage和他的团队使用循环排列来重新设计Cas9的分子序列,因而更好地控制它的活性并为融合蛋白构建更优化的DNA结合支架。这种Cas9重新连接方法涉及将这种蛋白的末端(即它的氨基端和羧基端)与肽接头(peptide linker)连接,同时在不同的位置上分割它的序列,从而产生新的相邻的氨基端和羧基端。

这些研究人员发现Cas9对循环排列具有很强的延展性。这种蛋白的多个区域具有热点,这些热点可在多个位置上打开,从而产生多样性的Cas9-CP,所产生的Cas9-CP可用作高级融合蛋白的支架。目前,Cas9的氨基端和羧基端是固定的,并且它们并不适合放置用于结合DNA的融合蛋白。相比之下,这些新的蛋白支架的末端更靠近这种蛋白的DNA相互作用界面,并且经优化后可高效地构建融合蛋白。

这些研究人员接下来通过设计肽接头来产生ProCas9,并且这种肽接头足够短以便将这种蛋白限制在没有活性的状态,随后引入可利用匹配的病毒蛋白酶加以切割的序列。此后,这些ProCas9经调整后可作为利他的能够检测病原体并对它们作出反应的防御系统。当通过切割这种肽接头激活这些ProCas9时,它们产生大量的DNA损伤并杀死受感染的细胞。

 

7.Nat Microbiol:基因编辑技术可以设计新型抗生素
doi:10.1038/s41564-018-0327-z

在最近一项研究中,威斯康星大学麦迪逊分校和加利福尼亚大学旧金山分校的的研究人员利用基因编辑工具CRISPR来研究特定抗生素靶向的基因,寻找如何改善现有抗生素或开发新抗生素的线索。

研究人员将Mobile-CRISPRi从常见的实验室菌株转移到不同的细菌中,甚至包括一些研究不多的微生物。这种易于转移的特性使得该技术成为科学家研究任何导致疾病的有效手段。

Peters与Carol Gross,Oren Rosenberg以及加州大学旧金山分校和其他机构的其他同事一起设计和测试了Mobile-CRISPRi。该系统减少了靶基因介导的蛋白质的产生,使研究人员能够确定抗生素如何抑制病原体的生长。相关成果于1月7日在
《Nature Microbiology》杂志上发表。作者们使用被称为CRISPRi的一种缺陷型CRISPR,它只是能够结合在DNA上,但无法切割DNA。这进一步阻止其他蛋白质进入并启动特定基因的表达。

 

8.JCI insight:CRISPR-CAS9 基因编辑技术用于治疗肌营养不良症
doi:10.1172/jci.insight.124297

CRISPR的基因编辑技术是治疗遗传性疾病的革命性方法。但是,该工具尚未用于有效治疗长期慢性病。由密苏里大学医学院的Dongsheng Duan博士领导的一个研究小组已经确定并克服了CRISPR基因编辑的障碍,这可能为使用该技术进行持续治疗奠定基础。 

CRISPR基因编辑的灵感来自于身体抵御病毒的天然防御能力。该技术使研究人员能够通过切除和替换基因组中的突变来改变DNA序列,该突变有可能治疗各种遗传疾病和病症。 Duan和他在美国国立卫生研究院和杜克大学推进转化科学国家中心MU的合作者正在研究如何利用CRISPR治疗Duchenne肌营养不良症(DMD)。

Duan的实验室使用CRISPR静脉内治疗6周龄DMD小鼠。他们最初采用了许多研究人员广泛使用的策略。在该方法中,施用相似量的Cas9和gRNA。虽然直接注入肌肉时效果很好,但当团队试图在身体的所有肌肉中实现长期矫正时,这种策略产生了不良后果。他们发现,骨骼肌中没有肌营养不良蛋白的恢复,心脏中的肌营养不良蛋白恢复很低 - 治疗无法阻止疾病进展。

9.Mol Cell:科学家破解出新型CRISPR代码 有望更加精准地进行人类基因组编辑

doi:10.1016/j.molcel.2018.11.031

近日,一项刊登在国际杂志
Molecular Cell上的研究报告中,来自Francis Crick研究所的科学家们通过研究发现了一组简单的规则或能决定人类细胞中CRISPR/Cas9基因编辑的精准性,相关研究结果或能帮助科学家们改善实验室和临床中基因编辑技术的效率和安全性。


尽管如今科学界已经广泛使用CRISPR系统了,但该技术的合理应用常常因为基因编辑结果的不可预测而受到重重障碍,基因编辑常常会带来靶向位点DNA区域的随机剔除或插入。

通过检测并分析CRISPR基因编辑技术对人类细胞450个基因的1491个靶向作用位点的作用效应,研究人员发现,基于简单的规则就能够有效预测基因编辑所带来的后果,这些规则主要依赖于导向RNA—Cas9所识别的特定基因组区域中的遗传元件。这项研究中,研究者发现,特定基因编辑的结果常常取决于RNA导向的第四个“字母元件”,其更靠近切割位点。


如果遗传元件是A或T,那么这将会是一个非常精准的基因插入,如果是C的话就会导致相对精准的剔除,而G的话则会造成多种不精准的剔除作用。因此,在基因编辑过程中,简单地避免含有碱基G的位点或许能够更加准确地预测基因编辑所产生的效果。

研究者Anob Chakrabarti指出,我们通过分析发现,决定CRISPR人类基因组编辑结果的规则实际上非常简单,在设计导向RNA时要记住这些规则,这样我们就能最大化的获得特定基因编辑的理想效果,这在临床中尤为重要。


同时研究者还阐明了开启或关闭靶向DNA如何影响基因编辑的效果,而加入促进DNA打开的化合物就能够促进Cas9搜寻基因组,从而提高编辑效率。


研究者表示,不管来源的组织如何(其会影响特定基因DNA开启的程度),靶向作用关键位置中含有碱基A或T的区域能够表现出常见的编辑效果,也就是说,如果我们能够仔细选择靶向DNA的话,我们就能够在不同组织中观察到相同的效应。


(本文转自生物谷)

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